مراحل کشت سلولی و اقدامات احتیاطی

1. بازیابی

●1. کرایویال را از نیتروژن مایع خارج کرده، بلافاصله آن را در یک حمام آب 37 درجه قرار داده و کمی تکان دهید. بعد از اینکه مایع ذوب شد (حدود 1-1.5 دقیقه) آن را خارج کرده و مقداری الکل اسپری کنید و روی میز کار فوق تمیز قرار دهید.

●2. سوسپانسیون سلولی فوق را در یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری پر از محیط 10 میلی لیتری آسپیره کنید (لوله انجماد را با محیط بشویید تا تمام سلول های چسبیده به دیواره بشویید) و به مدت 5 دقیقه با سرعت 1000 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید.

●3. مایع رویی را بریزید و 1 میلی لیتر محیط به آن اضافه کنید تا سلول ها معلق شوند. داخل پتری دیش 10 سانتی متری حاوی 10 میلی لیتر محیط کشت آسپیره شده و به آرامی به جلو و عقب تکان داده می شود تا سلول ها در پتری دیش به طور یکنواخت توزیع شوند.

●4. نوع سلول و تاریخ، نام کولتیواتور و غیره را برچسب بزنید و آن را در انکوباتور CO2 برای کشت قرار دهید. پس از چسبیدن سلول ها به دیوار، محیط را عوض کنید.

●5. هر 3 روز یک بار محیط را عوض کنید.

2. عبور

●1. زمانی که پوشش سلولی در ظرف کشت به 80 درصد -90 درصد رسید، عبور کنید.

●2. محیط اصلی را آسپیره کنید.

●3. تریپسین مناسب را اضافه کنید (فقط به اندازه ای که سلول ها را بپوشاند) و برای 1-2 دقیقه هضم کنید.

●4. پس از گرد شدن سلول ها، حجم مساوی از محیط حاوی سرم اضافه کنید تا هضم خاتمه یابد.

●5. از یک پیپت برای معلق کردن سلول ها با پیپت کردن استفاده کنید.

●6. سلول ها را در یک لوله سانتریفیوژ 15 میلی لیتری آسپیره کرده و با سرعت 1000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ کنید.

●7. مایع رویی را بریزید، 1-2ml محیط را اضافه کنید و سلول ها را باد کنید.

●8. بسته به نوع سلول سلول ها را به چند ظرف منتقل کنید. به طور کلی، 5 سلول سرطانی و 3 سلول طبیعی وجود دارد. به کشت ادامه دهید.

3. انجماد سلول ها را هضم کرده و سانتریفیوژ کنید (همان). سلول ها را با محلول انجماد آماده شده معلق کنید و آنها را در کریوویال های استریل شده توزیع کنید، بگذارید چند دقیقه بماند و نوع سلول و تاریخ انجماد را مشخص کنید. 4 درجه برای 30 دقیقه، -20 درجه برای 30 دقیقه، -80 درجه در طول شب، و سپس در نیتروژن مایع برای ذخیره سازی قرار دهید. تهیه محلول انجماد: 70 درصد محیط کامل به اضافه 20 درصد FBS به اضافه 10 درصد DMSO. DMSO باید به آرامی به صورت قطره ای اضافه شود و در حین چکیدن تکان بخورد.