در دوران پس از اپیدمی، اصطلاح "آزمایش اسید نوکلئیک" برای همه ما آشناست و به بخشی از زندگی روزمره ما تبدیل شده است.
بنابراین، آیا می دانید آزمایش اسید نوکلئیک چگونه ویروس ها را شناسایی می کند؟ و چگونه آزمایش اسید نوکلئیک ویروس های نامرئی را "مرئی" می کند؟
01 اسید نوکلئیک چیست؟
اسید نوکلئیک اصطلاح کلی برای DNA و RNA است.
اسید نوکلئیک جزء ضروری تمام حیات شناخته شده روی زمین است. DNA که اغلب می گوییم اسید دئوکسی ریبونوکلئیک است. ماده ژنتیکی کروناویروس جدید RNA - اسید ریبونوکلئیک است.
آزمایش تقویت اسید نوکلئیک
02 آزمایش اسید نوکلئیک دقیقاً چه چیزی را تشخیص می دهد؟
ماده برای تشخیص اسید نوکلئیک اسید نوکلئیک ویروس است.
کروناویروس جدید ویروسی است که فقط حاوی RNA است و توالی RNA خاص در ویروس نشانگری است که ویروس را از سایر پاتوژن ها متمایز می کند. تشخیص نوکلئیک اسید به این معنی است که آیا اسید نوکلئیک ویروس مهاجم خارجی در نمونه تنفسی یا خون بیمار وجود دارد تا مشخص شود که آیا او به ویروس کرونای جدید آلوده شده است یا خیر. اکثریت قریب به اتفاق تشخیص اسید نوکلئیک فعلی ویروس کرونای جدید از روش PCR کمی فلورسنت برای تقویت توالی هدف RNA ویروسی توسط PCR پس از رونویسی معکوس استفاده میکند.
PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز، یک تکنیک بیولوژی مولکولی است که برای تکثیر قطعات خاص DNA استفاده می شود. به واکنش کاتالیز شده با DNA پلیمراز ژن های خاص اشاره دارد یا واکنش تکثیر سریع در شرایط آزمایشگاهی توالی های DNA را تقویت ژن در شرایط آزمایشگاهی نیز می گویند. فناوری PCR کمی فلورسنت، اضافه کردن یک سیستم گزارشگر فلورسنت به سیستم واکنش PCR و استفاده از تغییر سیگنال فلورسنت برای نظارت بر فرآیند PCR در زمان واقعی است تا تشخیص کمی الگوی اولیه را محقق کند.
برای تشخیص نوکلئیک اسید، اولین قدم جمع آوری نمونه است. در حال حاضر، مرسوم ترین روش نمونه گیری این است: استفاده از سواب گلو یا سواب بینی برای پاک کردن و جمع آوری دستگاه تنفسی فوقانی (حلق یا حفره بینی). نمونه های جمع آوری شده کاملاً مهر و موم شده و سپس برای آزمایش تدریجی به آزمایشگاه ارسال می شود.
1. استخراج RNA ویروسی
ابتدا RNA ویروس از نمونه استخراج می شود. برای از بین بردن ویروس و آزادسازی اسید نوکلئیک، معرف های استخراج اسید نوکلئیک را به نمونه اضافه کنید.
2. "رونویسی معکوس" RNA ویروسی به cDNA
از طریق فناوری رونویسی معکوس (RT)، RNA ویروس به یک DNA خاص که تشخیص آن راحتتر است، یعنی cDNA، «معکوس» میشود.
3. تقویت و تشخیص cDNA
در واقع، چه سواب گلو، چه سواب بینی یا حتی نمونهگیری خون، محتوای ویروس در نمونه نسبتاً کم است، حتی در بیماران مبتلا به عفونت شدید (بار ویروسی زیاد است). از آنجایی که ذرات ویروس خیلی کوچک هستند و حجم نمونه برداری محدود است، تعداد ویروس های موجود در نمونه هنوز برای تشخیص اسید نوکلئیک بسیار کم است.
بنابراین، با استفاده از فناوری PCR، بازرسان «رمز عبور» منحصربهفرد ویروس کرونای جدید را در نمونه تقویت میکنند تا جایی که تجهیزات بتوانند آن را شناسایی کنند تا در مورد اینکه آیا عفونت مثبت است یا خیر. کل فرآیند گرفتن ماده ژنتیکی ویروس مانند ماهیگیری است. قلاب آن را شناسایی کرده و می گیرد تا ویروس جایی برای پنهان شدن نداشته باشد.
به عبارت ساده، برای تقویت تعداد cDNA است، به طوری که cDNA به طور مداوم تکرار می شود، به طوری که تعداد به صورت تصاعدی افزایش می یابد.
فرآیند استاندارد PCR به سه مرحله تقسیم می شود:
دناتوراسیون: استفاده از دمای بالا برای جداسازی دو رشته DNA. پیوندهای هیدروژنی بین رشته های دوتایی DNA در دمای بالا ({0}} درجه ) شکسته می شود.
بازپخت: پس از جدا شدن رشته های دوتایی DNA، دما کاهش می یابد تا پرایمرها به DNA تک رشته ای متصل شوند.
پسوند: DNA پلیمراز یک رشته مکمل را در امتداد رشته DNA از پرایمر متصل شده در هنگام کاهش دما سنتز می کند. هنگامی که ازدیاد طول کامل شد، یک چرخه کامل می شود و تعداد قطعات DNA دو برابر می شود. این سه مرحله را 25-35 بار تکرار کنید و تعداد قطعات DNA به صورت تصاعدی افزایش مییابد.
قالب دو رشته ای PCR
در حالی که cDNA در حال تقویت است، پروب های فلورسنت در کیت به طور همزمان کار می کنند. این یک سیگنال فلورسنت آزاد می کند و هر بار که cDNA تقویت می شود، سیگنال فلورسنت کمی افزایش می یابد و آشکارساز PCR می تواند مقدار Ct افزایش سیگنال فلورسنت را ثبت کند.
مقدار Ct یک شاخص مهم برای قضاوت در مورد منفی یا مثبت بودن اسید نوکلئیک ویروس است. هر چه DNA اولیه کمتر باشد، سیکل های PCR بیشتری برای رسیدن به یک آستانه خاص مورد نیاز است و مقدار Ct بالاتر می رود. برعکس، هرچه DNA اولیه بیشتر باشد، مقدار Ct کمتر است. مقدار اولیه DNA منعکس کننده مقدار RNA ویروسی در نمونه است که به نوبه خود میزان ویروس موجود در نمونه را منعکس می کند. بنابراین، اگر مقدار Ct تشخیص داده نشود یا بالاتر از مقدار معینی باشد، بیمار مشکوک منفی ارزیابی می شود. اگر کمتر از این مقدار باشد، بیمار مشکوک مثبت ارزیابی می شود.
در طی واکنش PCR، انتخاب مواد مصرفی PCR نیز یکی از مهم ترین عوامل موثر بر نتایج تشخیص اسید نوکلئیک است.