فناوری PCR باید پرایمرهای معقول و DNA نمونه استخراج شده را به طور مصنوعی سنتز کند و سپس چرخه حرارتی خودکار را انجام دهد و در نهایت شناسایی و تجزیه و تحلیل محصول را انجام دهد. در حال حاضر، طراحی و سنتز پرایمر تنها در چند مؤسسه تحقیقاتی، مؤسسه‌ها و کلینیک‌ها با قدرت فنی قوی قابل انجام است. برنامه برای شروع کار فقط نیاز به خرید کیت تشخیص PCR دارد. عوامل مؤثر زیادی در چرخه حرارتی خودکار PCR وجود دارد. برای نمونه های مختلف DNA، مقدار اجزای مختلف اضافه شده در واکنش PCR و پارامترهای چرخه دما متناقض است.
در حال حاضر چندین عامل اصلی تأثیرگذار به شرح زیر معرفی می شوند.
یک، پارامترهای چرخه دما
در سیکل حرارتی اتوماتیک PCR، مهم ترین عامل دمای دناتوراسیون و بازپخت است. همانطور که در مثال عملیات نشان داده شده است، شرایط دناتوراسیون، بازپخت و گسترش عبارتند از: 94 ℃ 60، 37 ℃ 60، 72 ℃ 120، در مجموع 25 ℃ 30 سیکل، قطعه تقویت شده 500 جفت باز است. در اینجا زمان هر مرحله باید پس از رسیدن مخلوط واکنش به دمای مورد نیاز محاسبه شود. در سیکلر حرارتی اتوماتیک، زمان از دمای اولیه مخلوط تا دمای مورد نیاز 30-60 ثانیه طول می کشد. طول این زمان تاخیر به عوامل مختلفی از جمله نوع لوله واکنش، ضخامت دیواره، حجم مخلوط واکنش، گرما بستگی دارد. منبع (حمام آب یا بلوک گرمایش)، و اختلاف دما بین دو مرحله، که باید در هنگام تنظیم چرخه حرارتی به اندازه کافی ارائه شود.
یکی دیگر از ملاحظات مهم در مورد زمان چرخه حرارتی فاصله بین دو آغازگر است. هر چه فاصله دورتر باشد، سنتز طول کامل دنباله هدف بیشتر طول می کشد. زمان واکنش داده شده در بالا بر اساس طول سنتز بهینه 500 جفت باز است. دنباله هدف ترسیم شده است. در اینجا مقدمه ای برای انتخاب دماهای مختلف آورده شده است.
1. دمای دناتوراسیون الگو دمای دناتوراسیون دمایی را تعیین می کند که در آن DNA دو رشته ای در واکنش PCR ذوب می شود. اگر دمای دناتوراسیون به دست نیاید، الگوی DNA تک رشته ای تولید نخواهد شد و PCR شروع نمی شود. دمای دناتوره شدن پایین به معنای دناتوره شدن ناقص است، DNA دو رشته ای به سرعت تغییر می کند و در نتیجه بازده را کاهش می دهد. به طور کلی 90 ~ 95 ℃. هنگامی که نمونه به این دما رسید، باید به سرعت تا دمای بازپخت سرد شود. دناتوره شدن DNA فقط چند ثانیه طول می کشد و برای مدت طولانی لازم نیست. برعکس، شما باید بهترین تلاش خود را در دمای بالا انجام دهید. برای حفظ فعالیت Taq DNA پلیمراز آن را کوتاه کنید. حداکثر دمای دناتوراسیون پس از افزودن Taq DNA پلیمراز نباید از 95 درجه سانتیگراد تجاوز کند.
2. دمای بازپخت پرایمر دمای بازپخت ویژگی و بازده PCR را تعیین می کند. اگر دما بالا باشد، ویژگی قوی است، اما اگر دما خیلی بالا باشد، پرایمر نمی تواند محکم با الگو ترکیب شود و بازده تقویت DNA کاهش می یابد. دما پایین است، بازده بالا است، اما خیلی کم می تواند باعث عدم تطابق پرایمر و الگو شود، محصولات غیر اختصاصی افزایش می یابد. به طور کلی، با شرایط واکنش 37 ℃ شروع کنید، مجموعه ای از واکنش های کنترلی را برای تعیین دمای بهینه بازپخت برای یک واکنش خاص تنظیم کنید. همچنین می توان بر اساس محتوای (G{3}}C) درصد پرایمرها برای درک آزمایش استنباط کرد. نقطه شروع آزمایش عمومی، دمای بازپخت Ta (دمای بازپخت) 5 درجه پایین‌تر از دمای ذوب است. TTm (دمای ذوب) پرایمر تقویتی که طبق فرمول قابل محاسبه است:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
در این میان، A، T، G و C به ترتیب تعداد پایه های مربوطه را نشان می دهند. به عنوان مثال، برای یک پرایمر 20 پایه، اگر محتوای (G+C)٪ 50٪ باشد، نقطه شروع Ta را می توان در 55 درجه سانتیگراد تنظیم کرد. در غلظت پرایمر معمولی (مانند 0.2μmol/L)، واکنش بازپخت را می توان در چند ثانیه کامل کرد و بازپخت طولانی مدت ضروری نیست.
3. انتخاب دمای گسترش پرایمر به دمای بهینه Taq DNA پلیمراز بستگی دارد. به طور کلی 70 ~ 75 ℃، نرخ استاندارد نوکلئوتیدهای کاتالیز شده با آنزیم در 72 ℃ می تواند به 35 تا 100 نوکلئوتید در ثانیه برسد. در هر دقیقه طول 1 کیلوبایت قابل افزایش است و سرعت آن به ترکیب محلول بافر، مقدار pH، غلظت نمک و ماهیت الگوی DNA بستگی دارد. اگر قطعه تقویت‌شده کوتاه‌تر از 150 جفت باز باشد، مرحله گسترش را می‌توان حذف کرد و به یک چرخه دمایی دوگانه تبدیل می‌شود، زیرا به دلیل Taq DNA، پلیمراز برای تکمیل سنتز توالی‌های کوتاه در دمای بازپخت کافی است. برای قطعات توالی کوتاه بین 100 تا 300 جفت باز، استفاده از یک چرخه دمای دوگانه سریع و ساده موثر است. در این زمان دمای گسترش پرایمر با دمای بازپخت برابر است. برای قطعات DNA بالای 1 کیلوبایت، زمان گسترش را می توان با توجه به طول قطعه در 1 تا 7 دقیقه کنترل کرد. در عین حال، ژلاتین یا معرف BSA باید به بافر PCR اضافه شود تا Taq DNA پلیمراز برای مدت طولانی فعال و پایدار بماند. رابطه ی جنسی؛ 15 تا 20 درصد گلیسرول به تکثیر حدود 2.5 کیلوبایت یا بیشتر قطعات DNA کمک می کند.
4. تعداد سیکل های PCR معمولی به طور کلی 25 تا 40 سیکل است. خطای کلی این است که تعداد چرخه ها زیاد است، پس زمینه غیر اختصاصی جدی است و پیچیدگی افزایش می یابد. البته تعداد چرخه های واکنش خیلی کم است و بازده کم است. بنابراین لازم است از به دست آمدن محصول اطمینان حاصل شود. با فرض نرخ، تعداد چرخه ها باید به حداقل برسد.
پس از تکمیل تکثیر، نمونه خنک شده و در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری می شود.
2. طراحی پرایمر
برای تکثیر DNA الگو، ابتدا باید دو پرایمر الیگونوکلئوتیدی طراحی کنید. به اصطلاح پرایمرها در واقع دو قطعه الیگونوکلئوتیدی هستند که مکمل توالی DNA هدف هستند که باید تکثیر شوند. فاصله بین دو پرایمر طول قطعه تقویت شده را تعیین می کند. 5'انتهای دو پرایمر موقعیت دو انتهای محصول تقویت شده را تعیین می کند. مشاهده می شود که پرایمرها کلید تعیین طول، موقعیت و نتایج قطعات تقویت شده با PCR هستند و طراحی پرایمر از اهمیت بیشتری برخوردار است.
شرط لازم برای طراحی پرایمر این است که توالی DNA هدف مکمل پرایمر باید شناخته شود. توالی بین دو پرایمر لزوماً مشخص نیست. دو توالی شناخته شده عموماً 15-20 باز هستند که می توانند با یک سنتز کننده DNA سنتز شوند. مربوط به دو پرایمر مکمل، علاوه بر این، اصولی که به طور کلی در طراحی پرایمر رعایت می شود عبارتند از:
1. طول پرایمر بر اساس آمار محاسبه می شود و احتمال اینکه یک توالی الیگونوکلئوتیدی حدود 17 باز در ژنوم انسان ظاهر شود یک بار است. بنابراین طول آغازگر معمولاً کمتر از 16 نوکلئوتید و بالاترین آن بیش از 30 نوکلئوتید نیست و بهترین طول آن 20-24 نوکلئوتید است. چنین اولیگونوکلئوتیدهای کوتاهی در دمای پلیمریزاسیون (گذر از 72 درجه سانتیگراد) هیبرید پایداری تشکیل نمی دهند. گاهی اوقات می تواند در 5' باشد. توالی‌هایی را که مکمل الگو نیستند، مانند مکان‌های آنزیم محدودکننده یا پروموترها، برای تکمیل شبیه‌سازی ژن و سایر نیازهای خاص اضافه کنید. پرایمر 5'برچسب بیوتین انتهایی یا برچسب فلورسنت را می توان برای اهداف مختلفی مانند تشخیص میکروبی استفاده کرد.
گاهی اوقات پرایمر' کار نمی کند، دلیل آن ناشناخته است، می توانید موقعیت را برای حل آن جابجا کنید.
2. ترکیب پرایمرهای محتوای (G{1}}C)% باید یکنواخت باشد و سعی کنید از پلیمر پایه یکسان خودداری کنید. محتوای (G{2}}C)٪ در دو پرایمر باید تا حد امکان مشابه باشد، در قطعه تقویت شده شناخته شده (G+C) % Content باید به قطعه ای که باید تقویت شود، به طور کلی نزدیک باشد. 40 تا 60 درصد بهتر است.
3. داخل پرایمر باید از تشکیل ساختارهای ثانویه آشکار، به ویژه ساختارهای سنجاق سر جلوگیری کند. مثلا:
4. نباید هیچ مکملی بین دو پرایمر بین پرایمرها وجود داشته باشد، به خصوص در انتهای پرایمر 3'. حتی اگر نتوان از آن اجتناب کرد، پایه مکمل 3'انتهای نباید از 2 باز بزرگتر باشد، در غیر این صورت تشکیل یک"primer dimer" یا"پرایمر دایمر" (دایمر پرایمر). به اصطلاح دایمر پرایمر در اصل یک قطعه DNA دو رشته ای است که با گسترش یک آغازگر بر روی توالی پرایمر دیگر تحت اثر DNA پلیمراز تشکیل می شود. ، محصول جانبی رایج PCR است و گاهی اوقات به محصول اصلی تبدیل می شود.
علاوه بر این، از توالی های همولوگ بین دو آغازگر، به ویژه قطعات الیگونوکلئوتیدی با بیش از 6 پایه یکسان متوالی خودداری کنید، در غیر این صورت این دو آغازگر برای یک مکان از الگو با یکدیگر رقابت خواهند کرد. به طور مشابه، پرایمرها و DNA هدف که باید تکثیر شوند یا سایر توالی های DNA نمونه نمی توانند توالی های همولوگ بیش از 6 باز داشته باشند. در غیر این صورت، پرایمرها به مکان های دیگر متصل می شوند و باعث کاهش تقویت اختصاصی و افزایش تقویت غیر اختصاصی می شوند.
5. پرایمر 3' پایان جفت DNA پلیمراز یک نوکلئوتید منفرد را به انتهای پرایمر 3' اضافه می کند. بنابراین، الزامات جفت شدن 5-6 باز از انتهای 3'؛ پرایمر و DNA هدف باید دقیق و دقیق باشد تا از تقویت موثر PCR اطمینان حاصل شود. .
معقول بودن طرح پرایمر را می توان با جستجوی کامپیوتری با استفاده از نرم افزار PCRDESN و نرم افزار American PRIMER تایید کرد.
الیگونوکلئوتیدهای سنتز شده مصنوعی ترجیحاً باید با کروماتوگرافی (کروماتوگرافی) یا PAGE خالص شوند تا ناخالصی هایی مانند زنجیره های کوتاهی که به طول کامل سنتز نشده اند حذف شوند. پرایمرهای خالص نگهداری شده در محلول استونیتریل 25 درصد در دمای 4 درجه سانتی گراد می توانند از میکروارگانیسم ها جلوگیری کنند در شرایط عادی، پرایمرهای استفاده نشده باید در یخچال با دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شوند. پرایمرها را می توان به مدت 6 ماه در مایع نگهداری کرد و پس از لیوفیلیزاسیون به مدت 1 تا 2 سال قابل نگهداری است.
