1. در صفحه کشت، لام هایی را که با PBS بالا رفته اند، سه بار به مدت 3 دقیقه خیس کنید.
2. اسلایدها را با 4 درصد پارا فرمالدئید به مدت 15 دقیقه ثابت کنید و لام ها را 3 بار و هر بار 3 دقیقه در PBS خیس کنید.
3. نفوذپذیری با 0.5 درصد Triton X-100 (تهیه شده در PBS) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق (برای آنتی ژن های بیان شده بر روی غشای سلولی، این مرحله حذف می شود).
4. مسدود کردن سرم: اسلایدها را 3 بار به مدت 3 دقیقه در PBS غوطه ور کنید، PBS را با کاغذ جاذب خشک کنید، سرم معمولی بز (به شرطی که منبع آنتی بادی ثانویه بز باشد) روی لام ها اضافه کنید و در دمای اتاق مسدود کنید. 30 دقیقه.
5. اضافه کردن آنتی بادی اولیه: محلول مسدود کننده را با کاغذ جاذب جذب کنید، شستشو ندهید، مقدار کافی آنتی بادی اولیه رقیق شده را به هر لام اضافه کنید و در جعبه مرطوب قرار دهید، در دمای 4 درجه یک شب انکوبه کنید.
6. افزودن آنتی بادی ثانویه فلورسنت: اسلایدها را 3 بار، هر بار 3 دقیقه در PBST غوطه ور کنید، مایع اضافی روی لام ها را با کاغذ جاذب جذب کنید، آنتی بادی ثانویه فلورسنت رقیق شده را به صورت قطره ای اضافه کنید، در درجه {3}} به مدت 1 ساعت انکوبه کنید. در یک جعبه مرطوب، 3 بار و هر بار 3 دقیقه در PBST Slice خیس کنید.
توجه: از افزودن آنتی بادی ثانویه فلورسنت، تمام مراحل بعدی باید تا حد امکان در مکانی تاریک انجام شود.
7. مسدود کردن سرم: مایع را با کاغذ جاذب پاک کنید، سرم معمولی بز را روی لام شیشه ای بریزید (به شرطی که منبع آنتی بادی ثانویه بز باشد) و در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه مسدود شود.
8. اضافه کردن آنتی بادی اولیه: محلول مسدود کننده را با کاغذ جاذب جذب کنید، شستشو ندهید، سپس آنتی بادی اولیه رقیق شده را به صورت قطره ای اضافه کنید و پس از افزودن آنتی بادی اولیه، یک شب در یک جعبه مرطوب 4 درجه در تاریکی انکوبه کنید. (توجه: گونه های دومین آنتی بادی اولیه با گونه های آنتی بادی اولیه اول مانند موش و خرگوش متفاوت است)
9. آنتی بادی ثانویه فلورسنت را اضافه کنید: اسلایدها را 3 بار، هر بار 3 دقیقه در PBST غوطه ور کنید، مایع اضافی روی لام ها را با کاغذ جاذب جذب کنید، آنتی بادی ثانویه فلورسنت رقیق شده را به صورت قطره ای اضافه کنید، در درجه {3}} به مدت 1 ساعت انکوبه کنید. در یک جعبه مرطوب، 3 بار و هر بار 3 دقیقه در PBST Slice خیس کنید. (توجه: اگر فلورسانس قرمز برای تشخیص اولین آنتی بادی انتخاب شود، دومی باید رنگ های فلورسانس دیگر را انتخاب کند)
10. ضد رنگ آمیزی هسته ها: DAPI به صورت قطره ای اضافه شد و به مدت 5 دقیقه در تاریکی انکوبه شد، نمونه ها رنگ آمیزی شدند و DAPI اضافی با PBST 5 دقیقه × 4 بار شسته شد.
11. مایع روی لام را با کاغذ جاذب خشک کنید، لام را با مایع نصب کننده حاوی خاموش کننده ضد فلورسانس ببندید و تصاویر را زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده و جمع آوری کنید.