کشت سلولی یکی از مهمترین ابزارهای مورد استفاده در زیست شناسی سلولی و مولکولی است که یک سیستم مدل عالی برای مطالعه فیزیولوژی و بیوشیمی طبیعی (به عنوان مثال، مطالعات متابولیک، پیری)، اثرات داروها و ترکیبات سمی بر سلول ها و همچنین اثرات آن ارائه می کند. جهش زایی و سرطان زایی سلولی همچنین در غربالگری و توسعه داروها و در تولید در مقیاس بزرگ ترکیبات بیولوژیکی (مانند واکسن ها، پروتئین های درمانی) استفاده می شود. مزیت اصلی استفاده از کشت سلولی برای هر یک از این کاربردها، سازگاری و تکرارپذیری نتایجی است که می توان با استفاده از دسته ای از سلول های کلونال به دست آورد.
کشت سلولی
کشت سلولی به حذف سلول ها از حیوانات یا گیاهان و رشد آنها در یک محیط مصنوعی مساعد اطلاق می شود. سلول ها را می توان به طور مستقیم از بافت جدا کرد و قبل از کشت به صورت آنزیمی یا مکانیکی جدا کرد، یا می توان آنها را از رده های سلولی یا سویه های ایجاد شده مشتق کرد.
1. آموزش ابتدایی
کشت اولیه به مرحله کشت پس از جداسازی سلول ها از بافت و تکثیر تحت شرایط مناسب تا زمانی که تمام بسترهای موجود را اشغال کنند (یعنی به محل تلاقی برسند) اشاره دارد. در این مرحله، سلول ها باید با انتقال آنها به ظرف جدید با محیط رشد تازه، زیر کشت شوند (یعنی پاساژ شوند) تا فضای بیشتری برای ادامه رشد فراهم شود.
2. خطوط سلولی
پس از اولین خرده کشت، کشت های اولیه رده های سلولی یا ساب کلون نامیده می شوند. ردههای سلولی مشتقشده از کشتهای اولیه، طول عمر محدودی دارند (یعنی محدود هستند) و هنگامی که عبور میکنند، سلولهایی با بالاترین پتانسیل رشد غالب میشوند و در نتیجه درجهای از یکنواختی ژنوتیپی و فنوتیپی در جنس جمعیت ایجاد میشود.
3. خطوط سلولی
یک رده سلولی به سویه سلولی تبدیل می شود اگر یک زیرجمعیت از رده سلولی به طور فعال از کشت با شبیه سازی یا روش های دیگر انتخاب شود. رده های سلولی اغلب پس از شروع خط والدین، تغییرات ژنتیکی بیشتری را به دست می آورند.
4. خطوط سلولی محدود و خطوط سلولی پیوسته
سلولهای طبیعی معمولاً قبل از از دست دادن توانایی خود برای تکثیر، فقط تعداد محدودی دفعات تقسیم میشوند، یک رویداد تعیینشده ژنتیکی به نام پیری. این خطوط سلولی محدود نامیده می شوند. با این حال، برخی از خطوط سلولی از طریق فرآیندی به نام تبدیل شدن، جاودانه می شوند که می تواند خود به خود رخ دهد یا به صورت شیمیایی یا ویروسی القا شود. یک رده سلولی محدود زمانی به یک خط سلولی پیوسته تبدیل میشود که دچار دگرگونی شود و توانایی تقسیم نامحدود را به دست آورد.
رده های سلولی به طور مداوم مستعد رانش ژنتیکی هستند، رده های سلولی محدود محکوم به پیری هستند، همه کشت های سلولی مستعد آلودگی میکروبی هستند و خرابی تجهیزات می تواند حتی در بهترین آزمایشگاه ها رخ دهد. از آنجایی که رده های سلولی ایجاد شده منبع ارزشمندی هستند که جایگزینی آنها پرهزینه و زمان بر است، حفظ سرما برای ذخیره سازی طولانی مدت ضروری است.
هنگامی که تعداد کمی از سلول های باقیمانده از زیر کشت به دست آمد، باید آنها را به عنوان ذخیره بذر منجمد کرد و از استفاده عمومی آزمایشگاهی محافظت کرد. ذخایر کار را می توان از ذخایر بذر منجمد تهیه و دوباره پر کرد. اگر ذخایر بذر تمام شود، می توان از ذخایر انجماد شده به عنوان منبعی برای تهیه ذخایر بذر تازه استفاده کرد و از انجماد اولیه کمترین مقدار را افزایش داد.
بهترین راه برای انجماد سلول های کشت شده در نیتروژن مایع، در محیط کامل، در حضور انجمادهایی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول است. یخ زدگی نقطه انجماد محیط را کاهش می دهد و همچنین سرعت خنک شدن را کاهش می دهد و خطر تشکیل کریستال یخ را تا حد زیادی کاهش می دهد که می تواند به سلول ها آسیب برساند و منجر به مرگ سلول شود.
DMSO برای تسهیل ورود مولکول های آلی به بافت ها شناخته شده است. هنگام کار با معرف های حاوی دی متیل سولفوکسید، باید از تجهیزات و روش های مناسب برای خطرات این ماده استفاده شود. معرف ها را طبق مقررات محلی دور بیندازید.
سلول ها را از ذخایر سلول های کاری منجمد رشد دهید
حتما دفترچه تلفن همراه بانک را پر کنید
تعداد معابر را تعیین کنید، به عنوان مثال اگر سلول های قبلی منجمد شده و سه بار ذوب شده باشند، فرآیند ذوب چهارمین گذر خواهد بود.
به فلاسک های T75 که دارای رده سلولی، شماره پاساژ و تاریخ هستند، محیط رشد (مینیمال محیط، سرم گوساله و آنتی بیوتیک ها) را اضافه کنید.
فلاسک را به صورت افقی در انکوباتور CO در دمای 37 درجه و 5 درصد CO به مدت حداقل 15 دقیقه قرار دهید. با این کار محیط گرم می شود و آن را به pH طبیعی خود می رساند (7.{4}}.6)
ویال های منجمد را با خطوط سلولی در حمام آب 37 درجه با هم زدن ملایم ذوب کنید. برای کاهش خطر آلودگی، اورینگ و درپوش را بالاتر از سطح آب (2-5 دقیقه) نگه دارید.
ویال را در یک کابینت ایمنی بیولوژیکی (BSL-2) قرار دهید. برای جلوگیری از آلودگی، قبل از باز کردن ویال، آن را با اتانول 70 درصد پاک کنید.
محتویات فلاسک سلولی منجمد را به یک فلاسک T75 حاوی محیط رشد منتقل کنید. فلاسک را به آرامی مخلوط کرده و تکان دهید تا سلول ها به طور یکنواخت روی سطح فلاسک توزیع شوند.
فلاسک را یک شب در انکوباتور CO2 در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 انکوبه کنید. اجازه دهید سلول ها در طول شب به هم بچسبند
تغییر محیط رشد
فلاسک را برای 2-4 روز دیگر در دمای 37 درجه، 5 درصد CO2 انکوبه کنید و تا زمانی که سلول ها رشد کنند نظارت کنید.
هنگامی که سلول ها به تقریباً 90 درصد تلاقی رسیدند، ذخیره سلولی را می توان با استفاده از فلاسک T150 گسترش داد.